細(xì)胞凋亡是一種正常的生理過程，發(fā)生在胚胎發(fā)育過程中以及組織穩(wěn)態(tài)的維持過程中。細(xì)胞凋亡程序的特征在于某些形態(tài)學(xué)特征，包括質(zhì)膜不對稱性和附著的喪失、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的濃縮以及 DNA 的核小體間裂解。質(zhì)膜缺失是最早的特征之一。在凋亡細(xì)胞中，膜磷脂磷脂酰絲氨酸 (PS) 從質(zhì)膜的內(nèi)部轉(zhuǎn)移到外部小葉，從而將 PS 暴露于外部細(xì)胞環(huán)境。Annexin V 是一種 35-36 kDa Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對 PS 具有高親和力，并與暴露的 PS 細(xì)胞結(jié)合。Annexin V 可以與包括 FITC 在內(nèi)的熒光染料結(jié)合。這種形式保留了其對 PS 的高親和力，因此可作為對正在發(fā)生凋亡的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析的靈敏探針。由于 PS 的外化發(fā)生在細(xì)胞凋亡的早期階段，因此 FITC Annexin V 染色可以比基于核變化（如 DNA 片段化）的檢測更早地識別細(xì)胞凋亡。
FITC Annexin V 染色發(fā)生在膜完整性喪失之前，伴隨著細(xì)胞凋亡或壞死過程導(dǎo)致的細(xì)胞死亡的新階段。因此，F(xiàn)ITC Annexin V 染色通常與活性染料（如碘化丙啶 (PI) 或 7-氨基放線菌素 (7-AAD)）結(jié)合使用，使研究人員能夠識別早期凋亡細(xì)胞（PI 陰性，F(xiàn)ITC Annexin V積極的）。具有完整膜的活細(xì)胞排除 PI，而死亡和受損細(xì)胞的膜可滲透 PI。例如，被認(rèn)為有活力的細(xì)胞是 FITC Annexin V 和 PI 陰性；早期凋亡細(xì)胞FITC Annexin V陽性，PI陰性；凋亡晚期或已經(jīng)死亡的細(xì)胞FITC Annexin V和PI均為陽性。該測定不區(qū)分經(jīng)歷凋亡死亡的細(xì)胞與因壞死途徑死亡的細(xì)胞，因為在任何一種情況下，死細(xì)胞都會被 FITC 膜聯(lián)蛋白 V 和 PI 染色。然而，當(dāng)隨著時間的推移測量細(xì)胞凋亡時，通?？梢宰粉櫦?xì)胞從 FITC Annexin V 和 PI 陰性（有活力或不可測量的細(xì)胞凋亡），到 FITC Annexin V 陽性和 PI 陰性（早期細(xì)胞凋亡，存在膜完整性），最后到FITC Annexin V 和 PI 陽性（終末期細(xì)胞凋亡和死亡）。細(xì)胞通過這三個階段的運動表明細(xì)胞凋亡。相比之下，表明細(xì)胞同時為 FITC Annexin V 和 PI 陽性的單一觀察結(jié)果本身揭示的關(guān)于細(xì)胞死亡過程的信息較少。死細(xì)胞會被 FITC Annexin V 和 PI 染色。然而，當(dāng)隨著時間的推移測量細(xì)胞凋亡時，通?？梢宰粉櫦?xì)胞從 FITC Annexin V 和 PI 陰性（有活力或不可測量的細(xì)胞凋亡），到 FITC Annexin V 陽性和 PI 陰性（早期細(xì)胞凋亡，存在膜完整性），最后到FITC Annexin V 和 PI 陽性（終末期細(xì)胞凋亡和死亡）。細(xì)胞通過這三個階段的運動表明細(xì)胞凋亡。相比之下，表明細(xì)胞同時為 FITC Annexin V 和 PI 陽性的單一觀察結(jié)果本身揭示的關(guān)于細(xì)胞死亡過程的信息較少。死細(xì)胞會被 FITC Annexin V 和 PI 染色。然而，當(dāng)隨著時間的推移測量細(xì)胞凋亡時，通?？梢宰粉櫦?xì)胞從 FITC Annexin V 和 PI 陰性（有活力或不可測量的細(xì)胞凋亡），到 FITC Annexin V 陽性和 PI 陰性（早期細(xì)胞凋亡，存在膜完整性），最后到FITC Annexin V 和 PI 陽性（終末期細(xì)胞凋亡和死亡）。細(xì)胞通過這三個階段的運動表明細(xì)胞凋亡。相比之下，表明細(xì)胞同時為 FITC Annexin V 和 PI 陽性的單一觀察結(jié)果本身揭示的關(guān)于細(xì)胞死亡過程的信息較少。存在膜完整性），最后變?yōu)?FITC Annexin V 和 PI 陽性（終末期細(xì)胞凋亡和死亡）。細(xì)胞通過這三個階段的運動表明細(xì)胞凋亡。相比之下，表明細(xì)胞同時為 FITC Annexin V 和 PI 陽性的單一觀察結(jié)果本身揭示的關(guān)于細(xì)胞死亡過程的信息較少。存在膜完整性），最后變?yōu)?FITC Annexin V 和 PI 陽性（終末期細(xì)胞凋亡和死亡）。細(xì)胞通過這三個階段的運動表明細(xì)胞凋亡。相比之下，表明細(xì)胞同時為 FITC Annexin V 和 PI 陽性的單一觀察結(jié)果本身揭示的關(guān)于細(xì)胞死亡過程的信息較少。
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FITC Annexin V 是一種用于識別凋亡細(xì)胞的靈敏探針，與帶負(fù)電荷的磷脂表面結(jié)合（Kd 約為 5 x 10^-2），對磷脂酰絲氨酸 (PS) 的親和力高于大多數(shù)其他磷脂。FITC Annexin V 結(jié)合是鈣依賴性的，如 FITC Annexin V 染色方案中所述，最佳染色需要確定的鈣和鹽濃度。 研究人員應(yīng)注意，F(xiàn)ITC Annexin V 對貼壁細(xì)胞類型（例如 HeLa、NIH 3T3 等）的流式細(xì)胞術(shù)分析并非常規(guī)測試，因為在細(xì)胞分離或收獲過程中可能會發(fā)生特定的膜損傷。然而，之前已經(jīng)報道了利用膜聯(lián)蛋白 V 對貼壁細(xì)胞類型進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的方法（Casiola-Rosen 等人和 van Engelend 等人）。
喜樹堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
提供以下協(xié)議作為說明如何在細(xì)胞系 (Jurkat) 上使用 FITC 膜聯(lián)蛋白 V。
材料
1. 制備喜樹堿儲備液（Sigma-Aldrich 目錄號 C-9911）：1 mM DMSO 溶液。
2. Jurkat T 細(xì)胞 (ATCC TIB-152)。
程序
1. 將喜樹堿（最終濃度 4-6 µM）添加到 1 x 10^6 Jurkat 細(xì)胞中。
2. 在 37°C 下孵育細(xì)胞 4-6 小時。
3. 繼續(xù)使用 FITC Annexin V 染色方案來測量細(xì)胞凋亡。
FITC 附聯(lián)蛋白 V 染色方案
FITC Annexin V 用于定量確定細(xì)胞群中正在積極經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞百分比。它依賴于細(xì)胞在細(xì)胞凋亡的早期階段失去膜不對稱性的特性。在凋亡細(xì)胞中，膜磷脂磷脂酰絲氨酸 (PS) 從質(zhì)膜的內(nèi)葉轉(zhuǎn)移到外葉，從而將 PS 暴露于外部環(huán)境。Annexin V 是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對 PS 具有高親和力，可用于鑒定暴露于 PS 的凋亡細(xì)胞。碘化丙啶 (PI) 是一種標(biāo)準(zhǔn)的流式細(xì)胞儀活性探針，用于區(qū)分活細(xì)胞和非活細(xì)胞。具有完整膜的活細(xì)胞排除 PI，而死細(xì)胞和受損細(xì)胞的膜可滲透 PI。FITC Annexin V 染色呈陽性而 PI 呈陰性的細(xì)胞正在發(fā)生凋亡。FITC Annexin V 和 PI 染色呈陽性的細(xì)胞要么處于細(xì)胞凋亡的末期，要么正在發(fā)生壞死，要么已經(jīng)死亡。FITC Annexin V 和 PI 染色均為陰性的細(xì)胞是活的，沒有發(fā)生可測量的細(xì)胞凋亡。
試劑
1. FITC Annexin V（成分編號 51-65874X）：每次測試使用 5 µl。
2. 碘化丙啶 (PI)（組分編號 51-66211E）是一種方便的即用型核酸染料。每次測試使用 5 µl。
3. 10X 膜聯(lián)蛋白 V 結(jié)合緩沖液（組分號 51-66121E）：0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4)、1.4 M NaCl、25 mM CaCl2。對于 1X 工作溶液，將 1 份 10X 膜聯(lián)蛋白 V 結(jié)合緩沖液稀釋至 9 份蒸餾水。
染色
1. 用冷 PBS 洗滌細(xì)胞兩次，然后以 1 x 10^6 個細(xì)胞/ml 的濃度在 1X 結(jié)合緩沖液中重懸細(xì)胞。
2. 將 100 µl 溶液（1 x 10^5 個細(xì)胞）轉(zhuǎn)移到 5 ml 培養(yǎng)管中。
3. 加入 5 µl FITC Annexin V 和 5 µl PI。
4. 輕輕渦旋細(xì)胞并在室溫 (25°C) 黑暗中孵育 15 分鐘。
5. 向每管中加入 400 µl 1X 結(jié)合緩沖液。在 1 小時內(nèi)通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
設(shè)置流式細(xì)胞術(shù)的建議控制
以下控件用于設(shè)置薪酬和象限：
1. 未染色的細(xì)胞。
2. 用 FITC Annexin V（無 PI）染色的細(xì)胞。
3. 用 PI 染色的細(xì)胞（無 FITC Annexin V）。
其他染色對照：
應(yīng)使用易于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞系來獲得 FITC 膜聯(lián)蛋白 V 和/或 FITC 膜聯(lián)蛋白 V 和 PI 的陽性對照染色。重要的是要注意細(xì)胞凋亡和壞死的基礎(chǔ)水平在人群中有很大差異。因此，即使在沒有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況下，大多數(shù)細(xì)胞群也會包含一小部分細(xì)胞凋亡陽性（FITC Annexin V 陽性，PI 陰性或 FITC Annexin V 陽性，PI 陽性）。
未處理的群體用于定義凋亡和死細(xì)胞的基礎(chǔ)水平。然后通過從處理過的細(xì)胞群中凋亡細(xì)胞的百分比中減去未處理過的細(xì)胞群中凋亡細(xì)胞的百分比來確定已經(jīng)被誘導(dǎo)經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的百分比。由于細(xì)胞死亡是細(xì)胞經(jīng)歷凋亡的最終結(jié)果，處于凋亡后期的細(xì)胞將有受損的細(xì)胞膜，并且 PI 和 FITC 膜聯(lián)蛋白 V 染色呈陽性。因此，該測定無法區(qū)分已經(jīng)經(jīng)歷過凋亡的細(xì)胞凋亡細(xì)胞死亡和那些因壞死途徑而死亡的細(xì)胞，因為在任何一種情況下，死細(xì)胞都會被 FITC Annexin V 和 PI 染色。
準(zhǔn)備和存儲
在 4°C 下未經(jīng)稀釋儲存，并避免長時間暴露在光線下。不要凍結(jié)。
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